ایران ایلب (Iranelab)مرجع علم و فناوری

1- جمع آوري بافت

2- پيش تيمار

3- تثبيت

4- هيدروليز

5- رنگ آميزي

6- اسكواش

تهيه و آماده سازي نمونه هاي كروموزومي وبررسي سيتولوژيكي آنها به روش اسكواش

جمع آوري ريشه ها:

ابتدا ريشه ها در حال رشد را  از بذرهاي جوانه زده (در ظرف پتري يا خاك گلدان) تهيه  میکنیم.  به طور معمول در آزمايشگاه ها،بذرهاي گياهي روي كاغذ صافي و در داخل ظرف پتري قرار داده مي شوند و ريشه ها بعد از جوانه زني بذر جمع آوري مي شوند.

پيش تيمار ريشه ها:

اين مرحله براي مشاهده ي كروموزوم هاي سوماتيكي مرحله اي مهم و اساسي محسوب مي شود.كه با استفاده ازآب سردانجام مي شوداين روش براي كروموزوم هاي غلات بسيار مؤثر است.

ريشه هاي با طول 5/1تا2 سانتيمتر،در لوله هاي آزمايشگاهي كوچك كه دوسوم حجم آنها با آب سرد(1درجه ي سانتيگراد)پر شده است قرار گرفته  وبه داخل ظرفي كه حاوي يخ-آب است،منتقل مي شوند.

تثبيت:

 نحوه ي تثبيت براي بررسي كروموزوم ها بسيار مهم است.نقش يك تثبيت كننده اين است كه سلول را در مرحله ي مناسبي از تقسيم سلولي متوقف و ثابت نگه دارد بدون آنكه تغييري در ساختار و شكل كروموزوم(تورم يا چروكيدگي) ايجاد شود.براي اين منظور ازمحلول كارنوي-1 استفاده ميشود.

روش تهيه محلول كارنوي-1  به صورت زیر می باشد.

(اين محلول به صورت يك جزءاسيد استيك سرد:سه جزء اتانول(100-95%) [3:1]تهيه و استفاده مي شود.نمونه هاي آزمايشي بايد دست كم به مدت24ساعت در تثبيت كننده نگه داشته شوند)

هيدروليزريشه:

 ابتدا براي تهيه ي نمونه ي ميكروسكوپي،بايد بافت هاي مذكور به منظور اسكواش و له كردن آماده شوند،.از اين رو بعد از تثبيت،ريشه هادر اسيد كلريدريك نرمال(1N HCl)و در دماي60 درجه ي سانتيگراد به مدت6تا15دقيقه قرار مي گيرد

رنگ آميزي ريشه:

انتهاي مريستمي ريشه پس از تثبيت و هيدروليز،از اسيد كلريدريك خارج شده و شست وشو داده مي شود براي اين منظور، به مدت 30دقيقه در محلول استوكارمن 1%قرار داده مي شود

براي رنگ پذيري بهتر بافت ها،ظرف(شيشه ي ساعت)حاوي استوكارمن در سطح شعله(غير مستقيم بهتر است)حرارت داده مي شود.

روش تهيه محلول استوكارمن 1% به صورت زیر می باشد 

- مواد لازم :

*1گرم پودر كارمن

*45ميلي ليتر اسيد استيك گلاسيال؛

*55ميلي ليتر آب دو بار تقطير.

- روش تهيه :

*اسيد استيك 45%را در زير هود مي جوشانيم؛

*سپس پودر كارمن را به اسيد استيك45%در حال جوش اضافه مي كنيم؛

*آن را به مدت5تا10دقيقه مي جوشانيم،و تكان مي دهيم تا رنگ آن قرمز تيره شود؛

*سپس آن را سرد كرده و با استفاده از كاغذ صافي صاف مي كنيم و سپس در يك ظرف رنگي شيشه اي و در يخچال نگه داري مي كنيم.

اسكواش: 

پس از رنگ آميزي ريشه در استوكارمن(يا استواورسئين)، بايد نوك ريشه را با تيغه جدا كرد و با سوزن آزمايشگاهي براي خرد كردن و له شدن بافت مريستمي نوك ريشه اقدام كرد.

نمونه بر روي لام قرار داده،سپس لامل را بر روي ان قرار دهيد.توسط شيئي مانند انتهاي خودكار چند ضربه ي آهسته(به طوري كه لامل حركت نكند)به لامل بزنيد،لام را تا نقطه ي زير جوش حرارت دهيد،سپس به سرعت آن را بين دو لايه كاغذ صافي اسكواش كنيد.